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Caspase-3活性检测试剂盒现货供应!

点击次数:32 发布时间:2020/1/16 11:10:33
 
Caspase-3活性检测试剂盒现货供应!


产品介绍:
Caspase-3 是 凋 亡 过 程 中 * 主 要 的 终 末 蛋 白 酶 , 也 是 研 究 * 多 的 caspase ; 它 激 活pro-caspase-2,6,7,9,特异水解多种关键凋亡蛋白如 PARP,介导染色质固缩、凋亡小体生成、核 DNA断裂。测定原理基于 Caspase-3 特异水解多肽底物 DEVD-pNA (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide),释放的游离硝基苯胺 pNA 在 405 nm 有*吸光度。采用可见光光度比色法测定 pNA 而得到 Caspase活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞 Caspase-3 活性。


所需仪器
可见光分光光度计配 100μl 比色杯,或酶标仪。*佳波长 405 nm,也可测 OD400~450 nm 但灵敏度略降。


操作步骤:
一、组织细胞准备:
Caspase活性测定值低,*常见原因是未发生凋亡或细胞量太少,其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时,并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时,以检测*佳的观察点。通常2×107细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1~3mg/ml蛋白。初次测定时,单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×106细胞或2个孔的6孔板细胞。*少,单个测定反应需加20μg蛋白对应于2×105个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和
leupeptin以免抑制Caspase活性。

1、(1)细胞裂解:1000g 5分钟收集细胞,吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100µl裂解液震荡裂解,冰浴10分钟,再次震荡。

(2) 组织裂解:3~10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器,上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。2、4 ºC 12,000g 10分钟,取上清测定,或-70 ºC保存。

3、蛋白定量:用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1-3mg/ml,相当于每10 μl待测样品含10-30μg蛋白,否则应增加细胞用量

 
样品测定操作:

1.按下表设置 96 孔板反应体系。底物*后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高,可增加或减少样品。

2.盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC反应2小时,肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2,此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜,但酶活性较强时,孵育时间过长将导致反应失去线性关系。

3.样品管OD405减去空白对照OD405,为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量,并以蛋白浓度校正之。

4.测得的Caspase酶活性表示方法有两种。
(1) Caspase活性增加的百分比:100% × 实验处理组OD / 实验对照组OD,简单而可靠。
(2) 样品Caspase酶活力单位 protein,精确但计算较复杂,参见说明。 


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